Sanidad

La línea de melanoma Ando2 obtenida del laboratorio del Dr. Pierre Coulie en Bruselas, deriva de una metástasis en el ganglio linfático clavicular izquierdo del paciente ANDO;  resultados previos de esta línea muestran que sólo expresa en superficie uno de sus haplotipos (correspondientes a los alelos HLA-A32, HLA-B40, HLA-Cw3).Se realizó un ensayo con 8 microsatélites del cromosoma 6 obteniendo una pérdida completa de uno de sus cromosomas 6. La línea de melanoma Ando2 fue transfectada con uno de sus alelos perdidos para poder determinar si la línea celular había sido inmunoseleccionada, se utilizo el vector pcDNA 3.1/V5-His-TOPO^® que permite realizar una clonación del producto de PCR con una elevada eficiencia; la línea celular resultante se denominó Ando-T1E3 (obteniendo varios clonos estables). El objetivo de la obtención de esta célula es el de realizar ensayos de estimulación de CTLs mediante cultivo de células tumorales y linfocitos (MLTC) por dilución límite (LDA), los resultados obtenidos muestran que existen linfocitos CD8⁺ capaces de reconocer específicamente a la línea transfectada con el gen HLA A*0201, luego la línea de melanoma ANDO-2 ha sido inmunoseleccionada. Para poder determinar la oncogenicidad de la línea ANDO2 se inyectaron 5×10⁶, 2.5×10⁶,1×10⁶ de células en la pata de ratones nu/nu ; la única dosis en la que se desarrolla el tumor es de 5×10⁶  células  y para nuestra sorpresa estudios de inmunofluorescencia a través de análisis por citometría de flujo mostraban una ausencia total de expresión en superficie de moléculas HLA de clase I y una expresión de novo de moléculas HLA de clase II, a esta línea celular la denominamos ANDO-NUDE que al ser tratada con IFN-γ recupera de nuevo su expresión de moléculas HLA en superficie. Con los resultados obtenidos tras el paso de la línea Ando2 en ratones nude, realizamos el mismo estudio con las líneas de melanoma Ando2, Ando-T1E3 y Ando-Nude. Se inyectaron 5×10⁶ de células en la pata de ratones nu/nu y SCID-Beige, cuando los tumores alcanzaban entre 8-10mm eran extirpados, disgregados y adaptados a cultivo haciendo un estudio de su fenotipo tanto del tumor disgregado como de la línea establecida en cultivo, las líneas obtenidas desde Ando2 en ratones SCID-Beige las denominamos SBAd -(1,2,3,4,5,6) mostrando una pérdida total del locus B y una bajada significativa del locus A, tras el tratamiento con IFN-γ recuperaban toda su expresión en superficie de moléculas HLA de clase I y una expresión de novo de moléculas HLA de clase II, los resultados en los  ensayos de citotoxicidad con las células mononucleares procedentes del bazo de los ratones fueron negativos, es decir, no existe interacción de las células blancas del ratón en nuestro sistema xenogénico, luego esta pérdida de expresión en superficie es un fenómeno intrínseco de la célula. El conjunto de las líneas celulares ANDO2, ANDO-T1E3, ANDO-Nude y SBAd constituyen el Sistema Ando-2, donde tenemos 4 líneas parenterales: Ando2 (expresión en superficie de un haplotipo HLA de clase I), Ando-T1E3 (expresión de un haplotipo más el transgen A2), Ando-Nude (ausencia total de expresión de moléculas HLA de clase I) y SBAd- (débil expresión del alelo A32) (Paco et al. Int. J. Cancer 2007). Para determinar la reproducibilidad de este fenómeno las líneas de melanoma pertenecientes al ESTAB (E-179, E-195 y FM93/2) que habían perdido un haplotipo se inyectaron 5×10⁶ de células en la pata de ratones nu/nu, resultados preliminares muestran  una pérdida completa del locus B y una bajada en la de expresión en superficie del locus A, determinando así que no es un fenómeno aislado del Sistema Ando2. Al mismo tiempo se realizaban ensayos de oncogenicidad de la líneas que componen el Sistema Ando2 donde la línea Ando2-Nude muestra una mayor oncogenicidad in vivo respecto a la línea Ando2 y Ando-T1E3, siendo ésta última rechazada por todos los ratones; debido a que son células parenterales y la diferencia principal entre ellas es en la expresión de moléculas HLA en superficie estamos desarrollando estudios de proliferación de hasta 96h in vitro de las líneas que conforman el Sistema Ando2, resultados preliminares muestran que la tasa de proliferación es semejante a la oncogenicidad in vivo. Estamos estudiando la relación que puede haber entre el HLA y la oncogenicidad tumoral. Vamos a iniciar un estudio de la regulación coordinada de la maquinaria de procesamiento antigénico (APM), así como de los posibles genes y proteínas que puedan estar implicados tanto en la regulación del HLA como en el ciclo celular. Carlos J. Casares Jiménez.

Las células NK constituyen aproximadamente 15% del total de linfocitos en personas saludables formando  parte de la inmunidad celular, su función principal es el reconocimiento de  “la ausencia de lo propio”, de este modo pueden controlar células que escapan al control del organismo, no obstante las células tumorales presentan unos de los problemas más graves  puesto que en su gran mayoría y de forma muy generalizada siguen expresando los mismos fenotipos de HLA en la superficie celular del individuo; las células tumorales al expresar en superficie las moléculas HLA, las células NK las reconocen como propias y éstas pasan desapercibidas a su control, por eso en estudio han usado la línea celular K562 cuya característica principal es la ausencia total en superficie de moléculas HLA, lo que la convierten en una diana extremadamente sensible a la lisis mediada por las células NK  en todos los ensayos de citotoxicidad realizados. Existen algunas enfermedades cancerosas como es el caso que presentan IMAI et al. Líneas celulares de una leucemia linfoblástica aguda donde mediante el uso de receptores quiméricos en las células NK primarias pueden solventar en parte la resistencia de las células cancerosas. En este estudio se basan en el concepto de que los receptores quiméricos en las células NK pueden tolerar las señales de inhibición mediadas por el HLA; así que para ello había que determinar las condiciones de cultivo más favorables para la expansión de células NK. Primero se desarrollo  un método novedoso que permitía una rápida y selectiva  proliferación de las células NK primarias CD56⁺CD3^- . Se logró una expresión estable de receptores quiméricos en células NK usando un vector retroviral pseudotipado consiguiendo expandir específicamente células NK primarias CD56⁺CD3^-   empleando varias citoquinas que las estimulan como la IL-2, IL-12, IL-15. Las células NK pueden ser estimuladas por dos moléculas que no contienen las células K562 en superficie, siendo uno de ellos el ligando 41BB que conduce a  señales de activación después de unirse al CD137 (41BB), que es expresado en la superficie de las células NK.Y la otra molécula es la IL-15, es una citoquina muy conocida, usada para la proliferación y supervivencia de las células NK. Por esto se paso a modificar genéticamente las células K562 obteniendo las líneas celulares que denominan K562-41BBL, K562mb15, K562-mb15-41BBL; estás células expresaran en superficie el ligando para 4-1BB, el receptor para IL-15 o ambos. Las células que provocan mayor proliferación de las células NK son las denominadas K562-mb15-41BBL, la contribución de la señalización a través de 4-1BB es importante sobre todo debido a su actividad antitumoral estos hallazgos también se han desarrollado mediante el uso de anticuerpos anti-41BB que activa las células NK murinas (Pan PY et al). La adición de 4-1BB está asociado a un incremento en la actividad celular, producción de IFN-γ y factores estimuladores de colonias de granulocitos y macrófagos.Las células NK de sangre periférica fueron obtenidas de pacientes ALL ( leucemia linfoblástica aguda). Tras una semana de cultivo con las células K562-mb15-41BBL se restablecieron en un rango entre 1350% y 3680%  respecto a los controles, la coexpresión en superficie de membrana de IL-15 y 4-1BBL actúa sinérgicamente aumentando  la proliferación de células NK CD56⁺CD3^-   sin la proliferación concomitante de Linfocitos T. Tras la expansión y transducción se obtuvieron altos niveles en superficie de receptores quiméricos en las células NK y a través de un análisis por Western Blotting  observaron que se expresaban en ambas configuraciones tanto monoméricas como diméricas. Entonces se analizaron los efectos relativos antileucémicos de las células NK modificadas genéticamente con receptores quiméricos contra CD19 expresado en las células B malignas. El incremento de la citotoxicidad de las células NK es llevado a cabo a través de  señales coestimulatorias mediadas por 4-1BB.Recientes estudios han enfatizado el potencial de la terapia con células NK en trasplantes alogénicos de células madre hematopoyéticas puesto que en modelos murinos de trasplante las células NK del donante pueden lisar células  leucémicas del hospedador. Infusiones de células T activas del donante pueden llevar a un alto riesgo de GvHD (enfermedad injerto contra el hospedador) mientras que infusiones puras de células NK CD56⁺CD3^-   no tienen ese riesgo. Las células NK alogénicas pueden ser más efectivas. Los ensayos de citotoxicidad contra las células de leucemia autólogas procedentes de muestras de médula ósea de líneas celulares ALL que expresan bajos niveles de HLA ,mostraban una  citotoxicidad  mas baja que la observada  con la línea celular K562, sólo un 50% de las células ALL  fueron lisadas con un radio 40:1 (célula efectora: célula diana), puesto que  expresan los alelos HLA-C que se unen a la mayoría de los receptores KIRs , confiriéndoles resistencia frente a las células NK , por el contrario  tenían una alta sensibilidad a las células NK que expresan anti-CD19. Con todo esto podemos concluir que  las células NK que expresan señales a través de los receptores quiméricos tienen mucho más poder de actividad antileucémica que las células NK no modificadas y pueden  lisar dianas celulares independientemente de su perfil HLA.Esta estrategia puede ser usada con numerosas moléculas identificadas como dianas potenciales de receptores quiméricos basados en la terapia celular en pacientes con cáncer (IMAI et al).